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PCR反應沒有目的片段考慮方面
日期：2025-05-07 04:20
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摘要：PCR反應沒有目的片段考慮方面:
1. 含有PCR反應抑制物
對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 后再擴增，并通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進行擴增，驗證抑制物的存在；
2. 模板濃度太低，擴增循環數不夠
盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的低溫度增加10個擴增循環；
3. 非特異擴增
增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，采用降落PCR和熱啟動PCR
4. 擴增反應混合液中各成分濃度不對
改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩沖液的pH
5. 原始模板濃度太低
使用巢式引物...
PCR反應沒有目的片段考慮方面:
1. 含有PCR反應抑制物
對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 后再擴增，并通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進行擴增，驗證抑制物的存在；
2. 模板濃度太低，擴增循環數不夠
盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的低溫度增加10個擴增循環；
3. 非特異擴增
增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，采用降落PCR和熱啟動PCR
4. 擴增反應混合液中各成分濃度不對
改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩沖液的pH
5. 原始模板濃度太低
使用巢式引物對第1次擴增產物進行稀釋（l :100 和1:1000)后擴增；
6. 擴增需要增強劑
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亞楓CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增強劑
7. 引物設計存在問題
重新設計引物
1. 含有PCR反應抑制物
對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 后再擴增，并通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進行擴增，驗證抑制物的存在；
2. 模板濃度太低，擴增循環數不夠
盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的低溫度增加10個擴增循環；
3. 非特異擴增
增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，采用降落PCR和熱啟動PCR
4. 擴增反應混合液中各成分濃度不對
改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩沖液的pH
5. 原始模板濃度太低
使用巢式引物對第1次擴增產物進行稀釋（l :100 和1:1000)后擴增；
6. 擴增需要增強劑
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亞楓CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增強劑
7. 引物設計存在問題
重新設計引物